流式染色完来不足上机该如何保存样本呢?38ab
短时候过夜保存的话不错将样本重悬在染色缓冲液Cell Staining buffer（Biolegend货号420201）中，4度避光保存；对于24-48h的保存，提议先将样本进行固定措置20min，再洗涤将细胞重悬于Cell Saining buffer中；对于更永劫候保存含胞内因子染色的样本，不错将细胞存放在Biolegend专用的流神气本保存液Cyto-Last Buffer，不错保存长达2周。对于流式固定的常见问题不错参考联接：https://mp.weixin.qq.com/s/wf5db7SfhhvGR7sGymTIVQ
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使用BioLegend抗体不错进行细胞分选吗？
一般来说Biolegend的抗体可用于细胞分选。但请正经，流式抗体未经内毒素测试并含有0.09%的叠氮化物，但含量较低不会影响细胞的活力。另外，抗体在4°C或冰上与细胞沿途孵育不错灵验认真细胞发生存化。
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惟有是荧光抗体就不错用于共聚焦显微镜吗?
一般情况下齐是不错的。但无意候强度不够，需要遴荐荧光强度大的染料。
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为什么CD68和CD206手脚CD分子也需要固定破膜？
绝大精深CD分子确乎是抒发在细胞膜外层的，但小鼠CD206（对应抗体克隆号C068C2）和CD68(对应抗体克隆号FA-11与Y1/82A)的抗体识别表位位于细胞膜的跨膜区，因此需要固定破膜的胞内染色智力赢得更好的阳性信号。
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若短时候无法对我的血液样本进行流式分析，那么应该如何保存？
血液样本簇新索求后提议室温保存并在8-12h内进行检测，这是由于血液样本中的粒细胞群半衰期较短；而室温保存下24h内进行流式检测对免疫表型竣事影响不大。另外对于抗凝剂的遴荐，大精深东谈主外周血样本在室温条款下保存于肝素钠抗凝管中比EDTA更清爽。对于血样样本保存的具体决策不错参考联接：https://mp.weixin.qq.com/s/o13zPXlLhF57jUP3Wfqw2g
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流式中检测细胞名义和细胞内卵白抒发水平的抗体有何别离?
抗体仅仅针对相应抗原的，至于是针对胞内依然胞膜对你检测来说并无明显影响，你只需要查澄澈到底是针对哪一个部位的抗原的，应该是不错用磨灭种抗体进行检测的，在流式操作时只需正经:要是是针对胞内，则需要加破膜剂，让抗体能和相应抗原营业，不然就不需要了
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如何正确使用花青素耦合的荧光抗体对单核细胞群体进行表型分析呢？
像PE/CY7、PE/CY5、PerCP/CY5.5等花青素染料，由于单核细胞高抒发Fc受体并可非特异性长入此类染料，流式染色时提议您使用Biolegend Fc受体阻断剂和单核细胞顽固剂True-Stain Monocyte Blocker （Biolegend货号 426101）以便在进行流式细胞术染色时减少布景。（图示为东谈主的PBMC样本染色同型对照抗体后未使用与使用单核细胞顽固剂的流式竣事对比图）
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如何遴荐相宜的流式破膜固定液？
不同筹办对固定破膜剂的要求不同。True-Nuclear转录因子试剂能为细胞核转录因子(比如FOXP3)提供了最好的染色条款。而Cyto-Fast Fix/Perm Buffer Set，可用于哺乳动物细胞的胞内因子染色的固定和破膜。另外，不同的品牌抗体和固定破膜剂不提议同期使用。
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核内因子（磷酸化卵白）是否不错与胞内细胞因子同期染色？
不保举将胞内和核内因子共同染色。要是检测的是核内因子咱们会保举 True-nuclear固定破膜液，核内筹办的破膜作用比细胞因子的愈加激烈，细胞因子容易向细胞外露馅导致阳性信号丢失。相悖，使用胞内染色固定/破膜缓冲液可或者不上打孔细胞核膜的作用，抗体由于未充分干预细胞核而导致染色竣事欠安。
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怎样遴荐流式同型对照?
同型对照(Isotype Control):使用与一抗相易种属开首、相易亚型、相易剂量和相易的免疫球卵白及亚型的免疫球卵白，用于摈斥由于抗体非特异性长入到细胞名义而产生的布景染色。要是一抗是多抗，不错用an normal serum(与一抗相易的普通血清) (must be the same species as primary antibody)。This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.这个不错揣摸试剂商。同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照。由于荧光标记单抗的组开首不同，应选择相易开首的未标记单抗手脚同型对照来转机布景染色。举个例子:比如检测一抗为单抗的mouse anti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的isotype 是mouse IgG2a， 是以不错用purified(纯化的) mouse IgG2a来作念OX-42的同型对照(Isotype Control)。一般的的生物本事公司和国内的代理齐有出售。
同型对照:是指与MoAb相易的、不免疫小鼠的免疫球卵白亚类，若使用平直免疫荧光染色法，同型对照也应标记荧光色素，如IgG1 FITC、IgG2a、PE等。主要议论了细胞的自愿荧光、FC受体介导的抗体长入和非特异性抗体长入等影响要素。此外，同型对照与MoAb所标记的荧光色素、浓度、F:P比值(标记的荧光色素与免疫球卵白分子的比值)应该相易为最好，这瞄准确设定阴性与阳性细胞的界标有遑急趣味，切忌使用与MoAb不相匹配的同型对照，最好为磨灭践诺室、袭取相易工艺或圭臬制备(如磨灭品牌)的居品。
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求教流式细胞术单抗平直荧光需要几种对照?
在线看a片领先阐述你用的直标抗体的荧光染料是什么，再确定该抗体的开首种属，遴荐相应的同型对照。如:你当今念念检测小鼠淋巴细胞名义的CD4抗原， 荧光染料为FITC， 抗体开首为大鼠的IgG1亚型， 即Rat anti Mouse CD4-FITC (IgG1)， 你所需要的同型对照就应该是Rat IgG1-FITC， 一般的抗体评释上齐会写清
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如何查找同型对照？
表面上需要遴荐相易品牌、相易荧光素、相易种属、相易重链和轻链的同型对照抗体，在BioLegend官网上的居品笃定页里不错找到保举的同型对照居品联接（位于下图紫色字体的Isotype Control处）。
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在进行胞内因子染色时， Fc Block试剂有多遑急?该如何诳骗?
Fc 受体的诳骗时特等必要的，尤其是用于单核细胞或粒细胞。FcBlock 应在固定破膜之前使用。现时 Biolegend 可提供针对小鼠（货号 101319）针对东谈主（货号 422301）的 Fc Block 居品。而对于东谈主类细胞的胞内染色，Fc受体的阻断并不是特等遑急。特定情况下检测东谈主类样本时，不错诳骗老例的阻断剂如相易物种的不有关纯化 Ig，或染色抗体开首物种的血清。
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布景荧光（非特异性染色）高
布景荧光高（即非特异性染色明显）可能是多种要素变成，举例荧光素、抗体、标记圭臬、仪器、其它试剂或数据分析等
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为什么流式抗体或ELISA的抗体很难诳骗于Western Blot践诺？
流式或ELISA抗体一般齐是识别抗原的3D构象和抗原决定簇的表位，但在WB践诺中，靶卵白由于高和煦SDS作用导致变性，其表位已发生更正，因此使用流式或ELISA的抗体无法识别抗原表位。
本期先到这里啦！敬请期待下一期。
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